vigneto Friuli

Estratto della tesi di laurea
 

"Studio di infezioni asintomatiche in vite
causate dal fitoplasma associato al legno nero"
 

Laureando: Devis Macor
Relatore: prof. Giuseppe Firrao
Correlatore: dott. Pierbruno Mutton

Obiettivi
Il principale obiettivo di questa tesi di laurea è quello di studiare il fenomeno della guarigione (o risanamento) in viti di cultivar Chardonnay dal legno nero della vite cercando di stabilirne le cause attraverso lo studio di infezioni asintomatiche.

Introduzione
Il legno nero della vite è un giallume causato da fitoplasmi. Questi sono eubatteri privi di parete cellulare appartenenti alla classe Mollicutes patogeni assoluti e non allevabili in vitro delle piante che vivono nei vasi floematici. Attraverso studi di biologia molecolare sulla regione del DNA codificante per la porzione 16S dell'RNA ribosomiale il fitoplasma che causa il legno nero è stato classificato nel gruppo 16Sr-XII. Questo giallume individuato per la prima volta in Francia nel 1960 si è diffuso in tutto il mondo ed è giunto anche nella nostra regione dove attualmente è presente in forma endemica. La trasmissione avviene per opera di insetti vettori della classe dei Rincota con apparato boccale pungente-succhiante. La sintomatologia è caratteristica dovuta prevalentemente al blocco della circolazione della linfa elaborata ed all'accumulo di amido nelle foglie. Queste si presentano bollose spesse e fragili con arrotolamento del lembo fogliare verso il basso fino ad assumere una tipica forma triangolare (detta "ad embrice") con decolorazioni giallo-dorate nei vitigni a uva gialla e rosso-vinate nei vitigni a uva rossa. I tralci presentano un'irregolare lignificazione e si notano delle pustole nerastre alla base degli stessi. Gli acini tendono ad appassire e successivamente a disseccare. Questa malattia in genere non porta alla morte della pianta ma ne compromette lo sviluppo e la produzione. La lotta diretta è possibile solo con antibiotici del gruppo delle tetracicline il cui uso non è consentito in Italia. L'unica lotta consentita è quella indiretta con trattamenti insetticidi contro i vettori oltre alla prevenzione utilizzando materiale propagativo sano ed impiantando cultivar resistenti/tolleranti al patogeno. Per diagnosticare questa malattia esistono diverse tecniche più o meno efficaci: la semplice osservazione dei sintomi la microscopia ottica in fluorescenza la microscopia elettronica i test sierologici con anticorpi specifici. Le più efficaci sono le tecniche di biologia molecolare (ibridazione con sonde oligonucleotidiche e amplificazione del DNA tramite analisi di PCR con primers specifici). Con queste tecniche è possibile distinguere il legno nero della vite da un altro importante giallume attualmente giunto in provincia di Pordenone e che causa gravi epidemie: la Flavescenza dorata della vite i cui sintomi sono identici ed indistinguibili da quelli del legno nero.
L'incidenza dei sintomi e la diffusione della malattia dipendono dalla combinazione di diversi fattori in particolare dalla suscettibilità varietale diffusione del vettore condizioni ambientali e virulenza del patogeno.
Dopo una fase epidemica iniziale con un picco di massima incidenza dei sintomi verso il 3-4 anno dalla prima manifestazione degli stessi la malattia tende ad assumere un andamento endemico con bassa incidenza dei sintomi. Questa fase è dovuta prevalentemente al fenomeno del risanamento consistente nella remissione spontanea dei sintomi da parte delle piante. Il risanamento è molto diffuso e come risulta da un'indagine svolta su vigneti di cultivar Chardonnay della nostra regione dal 1987 al 2000 interessa circa il 25% delle viti infette entro un anno dall'infezione e circa il 50% delle viti infette entro i 4 anni successivi alla prima manifestazione dei sintomi (Mutton et al. 2002).


Figura 1: sintomi evidenti da giallume su Chardonnay in un vigneto a Valvasone

Lavoro sperimentale
Per studiare il fenomeno del risanamento sono state selezionate 70 viti di cultivar Chardonnay utilizzando le mappe del S.A.A.S.D (settore agricoltura aziende sperimentali e dimostrative) della provincia di Pordenone nelle quali è riportata la storia delle piante nei vigneti monitorati dal 1987 in poi con l'indicazione per ogni anno della presenza dei sintomi delle principali patologie della vite compresi i giallumi. Sono state selezionate piante che dopo aver manifestato sintomi per un certo numero di anni erano guarite da uno due o tre anni.
Le piante individuate sono dislocate nei vigneti delle cinque aziende sotto riportate:

  • az. "Plozner" a Spilimbergo

  • az. "Pippo Americo" a Valvasone

  • az. "Nonis Romano" a S.Vito al Tagliamento

  • az. "Vigneti le Monde" a Prata di Pordenone

  • az. "Lazzarotto Edoardo" a Pasiano di Pordenone

Le piante sono state selezionate in campo con nastri colorati e cartellini numerati. Nell'estate 2000 è stato fatto un campionamento di materiale vegetale (foglie e tralci) ed i campioni sono stati portati nei laboratori del Dipartimento di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante per le analisi.
Tutti i campioni sono stati processati con l'estrazione del DNA dei fitoplasmi seguendo un protocollo che prevede la parziale purificazione dei fitoplasmi ottenuti dalle nervature delle foglie ed una precipitazione del DNA in isopropanolo.
Successivamente tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi di PCR (reazione a catena delle polimerasi) che permettono l'amplificazione del DNA grazie all'ibridazione con specifiche sequenze oligonucleotidiche dette primers ed all'attività polimerasica dell'enzima Taq DNA polimerasi.
Tutti i campioni sono stati sottoposti ad una analisi di PCR effettuata con i primers universali fD1/rP1 per procarioti consistente in un test di qualità del DNA estratto a cui tutti i campioni devono risultare positivi. Successivamente sono stati sottoposti a delle analisi di PCR specifiche per il fitoplasma associato al legno nero della vite una diretta ed una nested.
Le analisi di PCR dirette sono state svolte utilizzando la coppia di primers STOL11f2/STOL11r1 mentre nelle analisi di PCR nested è stata utilizzata la coppia di primers F6-R7 seguita da diluizione 1:500 ed amplificazione mediante analisi di PCR utilizzando la coppia di primers fSTOL/rSTOL del DNA in precedenza amplificato e diluito. L'analisi di PCR nested è più sensibile rispetto all'analisi di PCR diretta e nel corso dell'indagine diversi campioni che erano risultati positivi alla prima PCR sono stati negativi alla seconda.
Per visualizzare i risultati e sapere se un determinato campione è o meno infetto dal fitoplasma associato al legno nero della vite tutti i campioni di DNA amplificati tramite analisi di PCR vengono caricati su un gel di agarosio all'1% sottoposti ad una corsa elettroforetica a 100 volt quindi colorati in soluzione di etidio bromuro (molecola che si intercala alle basi azotate del DNA) ed il gel così colorato viene posto su un transilluminatore che emette raggi ultravioletti e fotografato con apposite apparecchiature. Il risultato come si può vedere nell'esempio sotto riportato consiste in una banda luminosa dovuta alla fluorescenza emessa dal bromuro d'etidio e la lettura della foto è relativamente semplice: la presenza della banda luminosa infatti indica la presenza del patogeno nel campione mentre la mancanza della banda luminosa indica l'assenza del fitoplasma.

Figura 2. Si riporta la foto della corsa elettroforetica su gel di agarosio (1% p/v) di un amplificato tramite analisi di PCR nested. Si notano procedendo da sinistra verso destra le bande dell'amplificazione del DNA di alcuni campioni analizzati il controllo negativo ed il DNA di riferimento per il peso molecolare "marker VI" (Roche). Sotto la foto è riportata la numerazione dei campioni.

Risultati
Confrontando la sintomatologia osservata in campo e documentata con fotografie digitali con i risultati di laboratorio che attestano la presenza o meno del fitoplasma nelle piante è stato possibile individuare le viti con infezioni asintomatiche ovvero piante in cui è stata rilevata la presenza del fitoplasma pur essendo queste perfettamente guarite.
Nell'estate 2000 su 70 piante analizzate sono state individuate 11 piante guarite in cui è stato rilevato il fitoplasma con le analisi di laboratorio e 2 piante che hanno presentato una riduzione dei sintomi ed in cui è stata rilevata la presenza del fitoplasma associato al legno nero della vite.
Le piante "interessanti" individuate sono state nuovamente analizzate nell'estate 2001 e di queste solo in 2 è stato nuovamente rilevato il fitoplasma mentre nell'estate 2002 è stato rilevato solo in una pianta. I dati dell'ultimo anno non sono però significativi in quanto diverse viti sono state estirpate.
Dai risultati ottenuti si possono fare le seguenti considerazioni.

  1. Per le 11 piante individuate si esclude la resistenza quale fenomeno del risanamento in quanto questa prevede l'incompatibilità tra pianta e patogeno e quindi l'assenza del fitoplasma.

  2. Si conclude quindi che il risanamento è dovuto alla selezione di un ceppo "attenuato" del fitoplasma associato al legno nero della vite non in grado di determinare sintomi probabilmente a causa di mutazioni genetiche che lo rendono inoffensivo.

  3. Si è potuta costatare la tendenza alla "scomparsa" del fitoplasma dalla chioma delle piante risanate nel corso degli anni. Infatti di 11 piante individuate nel 2000 nel 2001 solo in 2 è stato possibile rilevare ancora il fitoplasma.

  4. Si ipotizza per le restanti 59 piante guarite e negative alle analisi di laboratorio la "scomparsa" del fitoplasma nel corso degli anni come è stato osservato per le 11 viti individuate in questa indagine.

Conclusioni
Per la prima volta sono stati individuati fitoplasmi associati al legno nero della vite che non inducono sintomi nelle viti risanate.
I risultati ottenuti accreditano l'ipotesi che il fenomeno del risanamento sia dovuto alla selezione in planta di un ceppo "attenuato" del fitoplasma di cui si è evidenziata la tendenza alla "scomparsa" dalla chioma delle piante nel corso di uno o più anni.
 

Nel corso di questa tesi di laurea è stata svolta inoltre una breve indagine sulla Flavescenza dorata della vite che viene in seguito brevemente descritta.
Attraverso studi di biologia molecolare con l'analisi di PCR diretta (utilizzando la coppia di primers FD9f/FD9r) seguita dall'analisi RFLP (analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione) utilizzando l'enzima di restrizione AluI il fitoplasma associato alla Flavescenza dorata della vite giunta negli ultimi anni nella nostra regione in provincia di Pordenone è stato attribuito al sottogruppo 16 SrV-C. Questo sottogruppo è stato individuato inizialmente in provincia di Treviso ed i fitoplasmi appartenenti a questo sottogruppo sono considerati meno virulenti rispetto ai fitoplasmi appartenenti al sottogruppo 16SrV-D individuato inizialmente in provincia di Verona.

 

Dott. Devis Macor

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